Как работает высокоэффективная жидкостная хроматография?




 

Резервуар содержит растворитель [называемый подвижной фазой, потому что она движется]. Насос высокого давления [система подачи растворителя или менеджер растворителя] используется для создания и измерения определенной скорости потока подвижной фазы, обычно миллилитров в минуту. Инжектор [устройство управления пробами или автоматический пробоотборник] может вводить [вводить] пробу в непрерывно текущий поток подвижной фазы, который переносит пробу в колонку для ВЭЖХ.

Колонка содержит хроматографический набивочный материал, необходимый для разделения. Этот набивочный материал называется неподвижной фазой, потому что он удерживается на месте оборудованием колонки. Детектор необходим, чтобы увидеть разделенные полосы соединений по мере их элюирования из колонки ВЭЖХ [большинство соединений не имеют цвета, поэтому мы не можем видеть их нашими глазами]. Подвижная фаза выходит из детектора и может быть отправлена ​​в отходы или собрана по желанию. Когда подвижная фаза содержит отделенную полосу соединения, жидкостная хроматография дает возможность собрать эту фракцию элюата, содержащую это очищенное соединение, для дальнейшего изучения. Это называется препаративной хроматографией.

Обратите внимание, что трубки и фитинги высокого давления используются для соединения компонентов насоса, инжектора, колонки и детектора с целью формирования канала для подвижной фазы, образца и отдельных полос соединения.

Детектор подключен к компьютерной станции обработки данных, компоненту системы ВЭЖХ, который записывает электрический сигнал, необходимый для генерации хроматограммы на его дисплее, а также для идентификации и количественного определения концентрации компонентов образца (см. Рисунок F). Поскольку характеристики соединений образцов могут быть самыми разными, было разработано несколько типов детекторов. Например, если соединение может поглощать ультрафиолетовый свет, используется детектор УФ-поглощения.

Если соединение флуоресцирует, используется детектор флуоресценции. Если соединение не обладает ни одной из этих характеристик, используется более универсальный тип детектора, такой как испарительный детектор рассеяния света [ELSD]. Самый эффективный подход — это использование нескольких детекторов последовательно. Например, УФ- и / или ELSD-детектор можно использовать в сочетании с масс-спектрометром [MS] для анализа результатов хроматографического разделения. Это позволяет получить более полную информацию об аналите после однократной инъекции. Практика подключения масс-спектрометра к системе ВЭЖХ называется ЖХ / МС.

Операция ВЭЖХ

Подвижная фаза входит в колонку слева, проходит через слой частиц и выходит справа. Направление потока показано зелеными стрелками. Во-первых, рассмотрим верхнее изображение; он представляет столбец в нулевой момент времени [момент введения], когда образец входит в столбец и начинает формировать полосу. Показанный здесь образец представляет собой смесь желтого, красного и синего красителей и появляется на входе в колонку в виде одной черной полосы. [На самом деле, этот образец может быть чем угодно, что можно растворить в растворителе; обычно соединения будут бесцветными, а стенка колонки непрозрачной, поэтому нам потребуется детектор, чтобы увидеть разделенные соединения по мере их элюирования.]

Через несколько минут, в течение которых подвижная фаза непрерывно и устойчиво протекает мимо частиц упаковочного материала, мы можем видеть, что отдельные красители перемещались отдельными полосами с разной скоростью. Это связано с тем, что существует конкуренция между подвижной фазой и неподвижной фазой за привлечение каждого из красителей или аналитов. Обратите внимание, что полоса желтого красителя движется быстрее всех и вот-вот выйдет из колонки. Желтый краситель любит подвижную фазу [привлекается] больше, чем другие красители.

Следовательно, он движется с большей скоростью, ближе к скорости подвижной фазы. Синяя полоса красителя больше любит упаковочный материал, чем подвижную фазу. Его более сильное притяжение к частицам заставляет его двигаться значительно медленнее. Другими словами, это наиболее удерживаемое соединение в данной смеси образцов. Красная полоса красителя имеет промежуточное притяжение для подвижной фазы и поэтому движется через колонку с промежуточной скоростью. Поскольку каждая полоса красителя движется с разной скоростью, мы можем разделить ее хроматографически.