Як працює високоефективна рідинна хроматографія?




 

Резервуар містить розчинник [званий рухомий фазою, тому що вона рухається]. Насос високого тиску [система подачі розчинника або менеджер розчинника] використовується для створення та вимірювання певної швидкості потоку рухомої фази, зазвичай мілілітрів в хвилину. Інжектор [пристрій управління пробами або автоматичний пробовідбірник] може вводити [вводити] пробу в безперервно поточний потік рухомої фази, який переносить пробу в колонку для ВЕРХ.

Колонка містить хроматографический набивний матеріал, необхідний для поділу. Цей набивний матеріал називається нерухомою фазою, тому що він утримується на місці обладнанням колонки. Детектор необхідний, щоб побачити розділені смуги сполук в міру їх елюювання з колонки ВЕРХ [більшість з’єднань не мають кольору, тому ми не можемо бачити їх нашими очима]. Рухома фаза виходить з детектора і може бути відправлена ​​у відходи або зібрана за бажанням. Коли рухлива фаза містить відокремлену смугу з’єднання, ВЕРХ дає можливість зібрати цю фракцію елюата, що містить це очищене з’єднання, для подальшого вивчення. Це називається препаративної хроматографії [обговорюється в розділі, присвяченому шкалою ВЕРХ].

Зверніть увагу, що трубки та фітинги високого тиску використовуються для з’єднання компонентів насоса, інжектора, колонки і детектора з метою формування каналу для рухомої фази, зразка і окремих смуг з’єднання.

Детектор підключений до комп’ютерної станції обробки даних, компоненту системи ВЕРХ, який записує електричний сигнал, необхідний для генерації хроматограми на його дисплеї, а також для ідентифікації та кількісного визначення концентрації компонентів зразка (див. Малюнок F). Оскільки характеристики з’єднань зразків можуть бути самими різними, було розроблено кілька типів детекторів. Наприклад, якщо з’єднання може поглинати ультрафіолетове світло, використовується детектор УФ-поглинання.

Якщо з’єднання флуоресціює, використовується детектор флуоресценції. Якщо з’єднання не має жодної з цих характеристик, використовується більш універсальний тип детектора, такий як випарний детектор розсіювання світла [ELSD]. Найефективніший підхід — це використання декількох детекторів послідовно. Наприклад, УФ- і / або ELSD-детектор можна використовувати в поєднанні з мас-спектрометром [MS] для аналізу результатів хроматографічного розділення. Це дозволяє отримати більш повну інформацію про анал після одноразової ін’єкції. Практика підключення мас-спектрометра до системи ВЕРХ називається ЖХ / МС.

Операція ВЕРХ

Рухома фаза входить в колонку зліва, проходить через шар частинок і виходить справа. Напрямок потоку показано зеленими стрілками. По-перше, розглянемо верхнє зображення; він представляє стовпець в нульовий момент часу [момент введення], коли зразок входить в стовпець і починає формувати смугу. Показаний тут зразок являє собою суміш жовтого, червоного і синього барвників і з’являється на вході в колонку у вигляді однієї чорної смуги. [Насправді, цей зразок може бути чим завгодно, що можна розчинити в розчиннику; зазвичай сполуки будуть безбарвними, а стінка колонки непрозорою, тому нам буде потрібно детектор, щоб побачити розділені з’єднання в міру їх елюювання.]

Через кілька хвилин, протягом яких рухома фаза безперервно і стійко протікає повз частинок пакувального матеріалу, ми можемо бачити, що окремі барвники переміщалися окремими смугами з різною швидкістю. Це пов’язано з тим, що існує конкуренція між рухомою фазою і нерухомою фазою за залучення кожного з барвників або аналітів. Зверніть увагу, що смуга жовтого барвника рухається швидше за всіх і ось-ось вийде з колонки. Жовтий барвник любить рухливу фазу [залучається] більше, ніж інші барвники.

Отже, він рухається з більшою швидкістю, ближче до швидкості рухомої фази. Синя смуга барвника більше любить пакувальний матеріал, ніж рухливу фазу. Його сильніше тяжіння до частинкам змушує його рухатися значно повільніше. Іншими словами, це найбільш утримуванні в даній суміші зразків. Червона смуга барвника має проміжне тяжіння для рухомої фази і тому рухається через колонку з проміжною швидкістю. Оскільки кожна смуга барвника рухається з різною швидкістю, ми можемо розділити її хроматографически.